細胞與克隆技術(shù)論文

　　克隆技術(shù)是眾多具有極大影響力的技術(shù)之一。下面是小編精心推薦的細胞與克隆技術(shù)論文，希望你能有所感觸!

　　家兔克隆骨髓基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)

　　【摘要】 目的：探討家兔骨髓基質(zhì)細胞在體外傳代的培養(yǎng)。方法 取家兔股骨骨髓，分離骨髓基質(zhì)細胞，于1640培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，之后固定計數(shù)。結(jié)果 在2~6×106 個/cm2范圍內(nèi)，其接種細胞數(shù)與所形成的克隆集落(CFU-F)數(shù)呈良好線性關(guān)系。隨著培養(yǎng)時間的延長，克隆集落也增多，變大。3周齡家兔的造血基質(zhì)祖細胞較6周齡者為多。結(jié)論 基質(zhì)祖細胞CFU-F呈非均質(zhì)性的，可能存在不同亞群。

　　【關(guān)鍵詞】 家兔;骨髓;造血基質(zhì)祖細胞;克隆

　　骨髓基質(zhì)細胞是支持和調(diào)節(jié)造血細胞定居、增殖、分化、發(fā)育和成熟的內(nèi)環(huán)境主要細胞成分[1]。曾對小鼠體外單層培養(yǎng)造血基質(zhì)細胞的培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)其接種的細胞數(shù)與成集落數(shù)呈良好的線性關(guān)系[2]。目前對家兔的骨髓器官基質(zhì)細胞的研究國內(nèi)研究有過報道[3]。本文用體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞技術(shù)[4]對家兔的骨髓基質(zhì)細胞體外培養(yǎng)特點進行了探討。

　　1 資料與方法

　　1.1 材料來源 實驗動物系北京科宇動物養(yǎng)殖中心飼養(yǎng)的雌雄兩性、3~6周齡之純種家兔。

　　1.2 主要試劑與器材 RPME1640培養(yǎng)液，小牛血清(中國藥品生物制品檢定所)，平底中性玻璃培養(yǎng)瓶，二氧化碳孵箱，微孔濾網(wǎng)。

　　1.3 骨髓單個核細胞制備 6周齡家兔用乙醚麻醉處死;3周齡者則用頸椎脫臼致死。在無菌條件下取雙側(cè)股骨修潔后剪掉骺端，用帶16號針頭注射器以1640培養(yǎng)液沖出骨髓細胞，再用濾網(wǎng)過濾制取單個核細胞懸液，計數(shù)后用所需細胞量進行體外CFU-F培養(yǎng)。

　　1.4 CFU-F培養(yǎng)和測定 將6周齡家兔的骨髓細胞以2×106 個/cm2, 3周齡的以2~6×106 個/cm2置于含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)體系的培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于第4天，第6天用含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液換液，培養(yǎng)到第八天沖洗后用甲醛固定半小時，蒸餾水沖洗后用姬姆薩染色12 min后晾干，待計數(shù)用。

　　2 結(jié)果

　　2.1 CFU-F克隆集落形成過程觀察 于培養(yǎng)第4天在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞，發(fā)現(xiàn)淡紅色背景下(紅細胞)有圓形發(fā)亮的.較大基質(zhì)細胞生長，拉長的細胞較少見，振蕩后觀察未見發(fā)亮細胞浮起，說明細胞已貼壁。培養(yǎng)第六天鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞明顯增多，拉長者較多，形成了克隆集落，6周齡的骨髓基質(zhì)細胞 生長速度明顯低于3周齡者，且培養(yǎng)同天數(shù)的6周齡的克隆集落數(shù)明顯低于3周齡的克隆集落數(shù)。

　　2.2 CFU-F計數(shù) 計數(shù)由50個以上細胞所形成的集落數(shù)，結(jié)果如圖1、2和表1。由50~99個細胞組成的集落為小集落，由100~199個細胞組成的集落為中集落，>200個細胞者的為大集落。

　　3 討論

　　從以上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)時間越長，形成克隆集落相對越多，3周齡者，骨髓細胞較多，造血基質(zhì)祖細胞也較多，形成的克隆集落數(shù)也多。在2~6×106個/cm2范圍內(nèi)，形成的克隆集落數(shù)與種植細胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

　　通過對集落大小，所含細胞數(shù)與密度比較，表明CFU-F非均質(zhì)性的，可能存在不同亞群。這對體外培養(yǎng)骨髓細胞的增殖與分化有一定的指導(dǎo)意義。

　　參考文獻

　　[1] 姚程，彭麗萍，姜振宇,等.骨髓基質(zhì)細胞體外擴增能力及支持造血的研究.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2001,17(4)：386-388.

　　[2] 于洪臣, 郭占之, 畢曉穎, 等.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 1991,17(3):219.

　　[3] 王春艷，何欣，李增新,等.兔骨髓基質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)研究.北華大學(xué)學(xué)報，2005,6(6)：520-522.

　　[4] 蔡國鋒，黃開，章慶國.兔骨髓基質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)的實驗研究.東南大學(xué)學(xué)報，2006，25(1)：16-19.

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